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大鼠心肌梗死区胶原纤维和弹力纤维的动态医学变化及其与心功能的关系
 
 
[修改时间:2020-3-10 浏览次数:159]
 
 
前 言
 
心血管疾病是导致人类死亡的主要疾患之一,其中以冠心病、心肌梗死最为常见[1]。急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)是指急性心肌缺血导致心肌坏死的综合症在。由于其起病急骤变化迅速,极易因为心衰、休克与心律失常而导致心源性猝死[2],也是严重威胁人类健康的常见病、多发病。随着社会的发展和经济的进步,医疗环境不断得到改善,医疗技术得到了很大的提高,该病在诊断和治疗方面有了很大的进步,但目前仍然是世界上的主要死亡原因之一,有效的预防和治疗该病已成公共卫生事业发展的关键。心肌梗死后,心肌细胞因缺血缺氧坏死,心肌细胞和细胞间质的含量、致密度及其组成成分都会受到不同程度的损伤[3],胶原纤维和弹力纤维在细胞间质中对这种损伤首当其冲,也会同时受到一定程度的损害,进而重构。细胞外基质胶原网结构改变时,其中 I、III型胶原的结构改变、数量增加可致心脏硬度变大,顺应性变小,由于运动受限,心脏的舒张和收缩功能障碍都将受到影响,导致心功能障碍乃至发生心力衰竭[4]。有研究在大鼠心肌梗死模型上发现,弹性纤维在梗死后2周即可出现在梗死区瘢痕中,其含量变化也有明显的时相性[5]。
目前所能查阅到的文献,其研究仅停留在正常心肌和梗死后心肌间质中胶原纤维的变化[6],对梗死区域不同周次之间的动态变化研究很少,尤其是梗死区域不同周次的 I 型和 III 型胶原纤维的比例变化。正常心肌间质弹性纤维含量甚少[7],其变化受关注度不大,国内外鲜有报道,且仅停留在正常心脏层面,本实验以此为切入点,拟对大鼠急性心肌梗死后梗死区域瘢痕组织细胞间质中 I 型胶原纤维、III 型胶原纤维和弹力纤维及其蛋白不同周次的动态变化以及和心功能的关系进行探讨旨在为临床心肌梗死后再生提供新的研究思路,为心肌梗死后的临床治疗提供实验证据和理论参考。
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1 材料
 
1.1 实验动物
SD大鼠50只,体重200±20g,雌雄不限,其中对照组10只,模型组40只,左冠状动脉结扎法制备大鼠心肌梗死模型,并随机分为梗死后1周组、梗死后2周组、梗死后3周组、梗死后4周组,每组10只。实验动物均来源于新乡医学院动物中心,清洁级动物房内饲养,室温20~23℃,12h明暗交替,饲喂标准大鼠饲料与普通自来水,自由饮水与进食。
 
1.2 主要试剂与仪器
本研究所用各种材料和试剂的名称、产地和来源见表 1。实验过程所涉及的主要仪器和设备名称、产地和来源见表 2。
 
1.3 实验用液体的配制
 
1.3.1 10%水合氯醛的配置
水合氯醛粉末 10g,ddH2O 容量瓶定容至 100ml,过滤后密封避光室温保存。
 
1.3.2 4%多聚甲醛溶液的配制
称重台准确称取多聚甲醛粉末 40g,加入 PBS 溶液中,边加热边搅拌(操作过程需注意避光),加热至 60℃时加如 NaOH(1mol/L)至溶液清晰,室温冷却后加PBS 溶液调整体积至 1000ml,精确调节 PH 至 7.4,避光 4℃冰箱保存备用。
 
1.3.3 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制
取磷酸盐缓冲液干粉(Phosphated Buffered Saline,PBS)一袋,按说明书要求溶于三蒸水 2000ml 中,磁力搅拌器加热搅拌使其彻底溶解,用 HCL(1mol/L)和NaOH(1mol/L)调节 PH 至 7.4,分装后 4℃保存。
 
1.3.4 苏木素染色液的配制
称重台称取 22g 硫酸铝钾置于预热过的 500ml 蒸馏水中,同时将 2.5g 苏木素加入到 25ml 无水乙醇中,可用磁力搅拌器加速其溶解,待两种混合液体均完全溶解以后,将苏木素无水乙醇液体加入至硫酸铝价液体中并继续煮沸 1min,冷却至 91℃时缓慢将 1.25g 红色氧化汞加入上述液体中,继续加热直至液体变为紫红色,纱布封口后于冰水中完全冷却后过夜,第二天滤纸过滤后,加入 25ml 乙酸,室温保存备用。新配制好的苏木素染液呈紫红色,经过多次使用后颜色变浅,表面会形成一层氧化膜,此时苏木素染色能力已经下降,应该重新配制。
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材料与方法........7
结果........22
讨论....33
小结.......36
 
讨 论
 
急性心肌梗死(Acute myocardiac infarction, AMI)临床发病率、死亡率很高,是一种危害人类健康、影响生存质量的常见病、多发病。正常生理状况下,心肌细胞和心肌细胞间质网络一起,共同维持心脏形态和功能的正常[8]。心肌细胞外间质即心脏间质[9],间质中的胶原纤维、网状纤维和弹力纤维等,是心脏的重要组成成分,其中胶原纤维是心脏细胞纤维的主要组成部分,尤其是I型和III型胶原纤维,弹性纤维是结缔组织的重要成分,它可以赋予所在组织良好弹性。正常情况下各类型胶原纤维在心脏间质中相互连接,形成了一个复杂的三维空间结构[12],这就是胶原网络,其中I型胶原纤维约占五分之四,它抗牵拉却少有弹性,因此伸展回缩性能不佳,它的存在决定心肌收缩和舒张时的僵硬度;III型胶原纤维约占11%-15%左右,特征为纤维比较细,弹性良好,是间质胶原中负责心肌弹力伸张的主要成分[13, 14]。AMI后瘢痕组织逐渐替代梗死部分的心肌,严重情况下甚至会出现心力衰竭,引起心功能的变化,在整个心肌梗死区域变化过程中,不仅心肌细胞发生变化,细胞间质中的各种成分尤其是间质中的胶原纤维和弹力纤维均发生了重大改变[15]。目前对心肌梗死后心肌细胞的变化和毛细血管的新生研究较多[16],有关心肌间质中弹性纤维和胶原纤维的动态变化及其与心功能变化的关系研究较少[17]。胶原纤维、网状纤维和弹力纤维等是心脏的重要组成成分,也是心肌复杂的纤维网络支架的重要组成成分,他们在功能上各司其职却又相辅相成,共同维护心脏正常的结构和功能[18]。他们在不同年龄段结构数量有差别,从胚胎到成年均逐渐增加,这几种纤维在幼年至青年时期是增加比较快的时期,至成年以后各种数量和理化性质逐渐趋于稳定[19, 20]。弹性纤维在心脏中虽不如胶原纤维数量多,但对维持心脏的正常形态和功能仍发挥着不可缺少的作用,比如胶原纤维和弹力纤维数量和比例失去原有的正常状态,不仅能够引起心脏的收缩、舒张功能和正常心肌的电生理发生变化,更甚者还可能参与心力衰竭的发生、发展,使潜在的心血管事件发生率升高[21]。急性心肌梗死后,冠状动脉完全或部分闭塞,使部分心肌因严重的或持久性缺血而发生局部坏死,也对细胞间质中的胶原纤维和弹力纤维有一定的损害,造成心肌间质细胞的增生及胶原的堆积和弹力纤维的丢失,各型胶原排列紊乱,比例失调,引起心肌纤维化和心室重构[22]。胶原纤维异常增多且比例失调(比如I/III 型胶原比例升高) 可以使心室壁的硬度增加,顺应性下降,引起心脏舒张、收缩功能障碍,在心动周期的舒张期充盈受限。在心肌梗死后瘢痕愈合的不同时期,瘢痕结构存在差异,其中I型胶原纤维、III型胶原纤维和弹力纤维随着病程变化不断调整其结构和含量,这些纤维成分的结构和含量变化决定着心室壁的顺应性和抗张强度改变,从而直接影响梗死后的心脏愈合不能正常进行[19],从而影响心脏的功能,导致梗死后的心室重构,结构的改变会影响功能的正常状态,从而引起心功能障碍甚至发生心力衰竭[16]。梗死后不同时期,不同类型的胶原在数量和结构上不断变化,提示心肌梗死区域首先表现出胶原基质的反应性增生来修复受损心肌和阻止梗死的进一步发展,随后的稳定时期,以大量III型胶原构成的细小纤维填充修复被吸收的坏死心肌,后期粗大纤维的I型胶原纤维出现在尚未成熟的瘢痕中,瘢痕组织强度进一步增加来防止心脏舒张功障碍引起的心血管事件[23, 24]。
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小 结
 
本实验利用左冠状动脉结扎方法制备了大鼠心肌梗死模型。采用小动物超声成像系统分别监测对照组和梗死后1周、2周、3周和4周的心电图和心功能变化,利用组织学方法确定心肌梗死模型制备是否成功,用利用免疫组化、免疫荧光、Western Blotting等技术,监测了大鼠心肌梗死后不同周次弹力纤维、I型胶原纤维和III型胶原纤维的动态变化,比较大鼠心肌梗死后不同周次弹力纤维、I型胶原纤维和III型胶原纤维的动态变化与心功能的关系。结果显示:随着梗死周次的增加,模型大鼠心功能逐渐降低。正常大鼠心功能(74.90%±4.13),梗死后第1周(58.00%±2.38),第2周(51.74%±2.16),第3周(37.50%±3.00),第4周降至(28.92%±2.83)。在心肌梗死区域,随梗死时间延长弹力纤维呈递减趋势。正常大鼠心肌弹力纤维含量为(0.97±0.05),梗死后1周为(0.95±0.04),第2周为(0.22±0.01),减少幅度最大;第3周为(0.13±0.01),梗死后4周组为(0.03±0.004)。I型胶原纤维含量逐渐增加,对照组为(0.471±0.035),梗死后第1周(0.632±0.045),2周组为(0.925±0.107),第3周为(1.071±0.099),4周组为(1.114±0.057)。随梗死时间延长,III型胶原含量逐渐增加,对照组为(0.335±0.078),梗死后第1周(0.374±0.018),2周组为(0.469±0.035),梗死3周(0.578±0.021),第4周组为 (1.134±0.039) 。这些研究结果提示:随心肌梗死时间的延长,梗死区域I型和III型胶原含量逐渐增多,而弹力纤维成分逐渐下降,这些蛋白的重构可能是梗死瘢痕区域僵硬度增加、弹性下降的病理学基础。心功能的降低与弹性纤维减少成正比,与胶原的增加成反比。这为心肌再生提供了新的研究思路,也为心肌梗死后的临床治疗提供了实验依据和理论参考。
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参考文献(略)
 
 

 

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